Ученые демонстрируют стойкость и упорство в своих экспедициях
По дороге в Лонгйир, крупнейший город на норвежском одноименном архипелаге, из горы песчаника выступает бетонное сооружение. Это вход в Глобальное хранилище семян или или Хранилище Судного дня, где под землей хранится более миллиона образцов пшеницы, риса, кукурузы и других культур на случай глобальной катастрофы. Однако ученые видят в нем не только склад, но и возможность для поиска хранившихся тысячелетиями вирусов. Об одной из таких экспедиций написали в Science.
Морозильная камера хранит свои тайны
Хранилище расположено здесь, потому что даже если система охлаждения, поддерживающая температуру семян на уровне минус 18 градусов, выйдет из строя, замерзшая земля обеспечит сохранность семян на сотни лет. Здесь, примерно в 1300 километрах от Северного полюса, земля сама по себе служит морозильной камерой.
По этой же причине Себастьен Кальвиньяк-Спенсер (Sébastien Calvignac-Spencer) приехал на Шпицберген в середине июля. Биолог-эволюционист из Института единого здоровья имени Гельмгольца, интересуется эволюцией вирусов, геномы которых состоят из РНК — более хрупкой молекулы, чем родственная ей ДНК.
Древние последовательности ДНК, сохранившиеся на протяжении тысячелетий, изменили представления ученых об истории бактериальных заболеваний, таких как чума и сифилис, а также оспы, вызываемой вирусом с ДНК-геномом. Они также произвели революцию в нашем понимании происхождения человека и миграции народов.
Древняя РНК может хранить свои собственные тайны, в том числе о том, как эволюционировали вирусы, вызывающие грипп, полиомиелит и лихорадку Эбола, и как изменились их отношения с животными и людьми, например, в связи с промышленной революцией или развитием современного сельского хозяйства. Но до сих пор было секвенировано очень мало образцов древней РНК.
Лишь немногие из опубликованных образцов старше 100 лет, и некоторые из них, как принято считать, являются лабораторными ошибками. Кальвиньяк-Спенсер признает, что РНК обычно разрушается быстрее, чем ДНК. Но он считает, что ее хрупкость стала догмой, из-за которой исследователи даже не пытаются ее искать.
В последние годы он добился ряда успехов в восстановлении старых геномов кори, гриппа и других вирусов из образцов тканей, зафиксированных в формалине, которые хранятся в музеях. На Шпицбергене он надеется показать, что в холодной и сухой вечной мерзлоте геномы РНК-вирусов могут сохраняться гораздо дольше — возможно, тысячи или даже сотни тысяч лет.
«У них здесь хранилище семян, а может, и вирусов тоже есть», — говорит он.
Хендрик Пойнар (Hendrik Poinar)возглавляющий Центр изучения древней ДНК в Университете Макмастера, с нетерпением ждет результатов работы Кальвиньяка-Спенсера. Он согласен с тем, что хрупкость РНК иногда преувеличивают, и прогнозирует, что новые методы, некоторые из которых разрабатываются в его собственной лаборатории, вскоре дадут мощный толчок развитию этой области. «Я думаю, что очень скоро в этой сфере произойдет революция», — говорит Пойнар.
Хотел быть палеонтологом, но связал жизнь с вирусами
Лонгйир, самый северный город в мире, — необычное место. Летом солнце не заходит около 4 месяцев, и население города, насчитывающее около 2000 человек, удваивается за счет притока туристов и исследователей. Постоянный свет может как заряжать энергией, так и немного дезориентировать. За пределами города необходимо иметь при себе оружие из-за риска нападения белого медведя. (Последней жертвой стал турист из Нидерландов, убитый в кемпинге недалеко от аэропорта в 2020 году.)
Проработав всю свою карьеру в офисах и лабораториях, «я сам был немного удивлён тем, что оказался на Шпицбергене», — говорит Кальвиньяк-Спенсер. Однако в остальном он оказался именно там, где хотел быть.
В детстве, когда Кальвиньяк-Спенсер жил в Тулузе, Франция, он увлекался динозаврами и мечтал стать палеонтологом. Для получения докторской степени он поступил в лабораторию древней ДНК Лионского университета, где частично занимался бурыми медведями, а частично — ретровирусами у людей и человекообразных обезьян.
«Это заставило меня понять, что на самом деле меня интересует эволюция инфекционных агентов», — говорит он. В 2010 году, после получения докторской степени, он присоединился к Фабиану Линдерцу, ветеринару, специализирующемуся на дикой природе, который тогда работал в Институте Роберта Коха и изучал патогены у шимпанзе в национальном парке Тай в Кот-д’Ивуаре.
Работа в Берлине не была связана с древними образцами, но Кальвиньяк-Спенсер внимательно следил за развитием области изучения древней ДНК, которая в то время стремительно развивалась. В 2017 году, когда их группа переехала в новое здание в Берлине, Линдерц и Кальвиньяк-Спенсер решили превратить часть свободных лабораторных помещений в лабораторию палеогенетики, отчасти для того, чтобы распространить свою работу по изучению экологии болезней человекообразных обезьян на прошлое.
Для Кальвиньяка-Спенсера это также была возможность взглянуть на эволюцию инфекций в более широком смысле. Исследователи ДНК изучали патогены, существовавшие тысячи лет назад, но он увидел нишу для себя в анализе РНК-вирусов из более поздних образцов. Во-первых, по его словам, за последние 200 лет произошли важные изменения, которые могли повлиять на эволюцию вирусов: вспомните промышленную революцию, масштабные изменения в сельском хозяйстве или повсеместное внедрение вакцин.
Исследовал даже смертоносную «испанку»
Исследователи могут частично восстановить историю вируса, сравнив современные геномы и используя скорость геномных изменений, чтобы вычислить, когда существовал их общий предок и как он мог выглядеть. Но поскольку РНК-вирусы быстро мутируют, эта стратегия не позволяет заглянуть далеко в прошлое. Например, последний известный общий предок респираторно-синцитиального вируса появился в XX веке; шесть из восьми сегментов генома вируса гриппа восходят к XIX веку.
«Таким образом, мы быстро достигаем своего рода филогенетического горизонта и не видим ничего за его пределами», — говорит Кальвиньяк-Спенсер.
Древняя РНК может обойти это ограничение, но найти ее сложно. Бактерии, вызывающие сифилис и проказу, оставляют на человеческих скелетах следы, которые могут помочь исследователям их обнаружить. РНК-вирусы редко оставляют какие-либо следы, «поэтому приходится обрабатывать большой объем материала в надежде, что вам повезёт», — говорит Люси ван Дорп, генетик-микробиолог из Университетского колледжа Лондона.
Кальвиньяк-Спенсер решил попробовать использовать коллекции патологических образцов. Он начал со старой коллекции, которая хранилась недалеко от его лаборатории, в Берлинском музее истории медицины Шарите. Для первого пробного запуска он выбрал 12 образцов, зафиксированных в формалине в начале XX века.
Одним из них было легкое двухлетнего ребенка, умершего от кори в 1912 году. Кальвиньяку-Спенсеру удалось собрать из него целый вирусный геном — это самый старый РНК-содержащий вирус человека, генетический код которого был расшифрован.
В статье опубликованной в Science в 2020 году он использовал этот геном и более современные геномы, чтобы определить, когда корь могла перейти от крупного рогатого скота к человеку: не в Средние века, как предполагали более ранние исследования, а уже в 500 году до н. э., когда города стали достаточно большими, чтобы обеспечить непрерывное распространение инфекции.
Другие образцы, полученные в ходе первого тралового прочесывания коллекции, содержали одну полную и две частичные последовательности вируса, который вызвал пандемию гриппа 1918 года, также известную как «испанка».
Команда под руководством вирусолога Джеффри Таубенбергера, ныне исполняющего обязанности директора Национального института аллергии и инфекционных заболеваний США, впервые секвенировала этот вирус в 2005 году, в основном на основе образцов, взятых у пациента, похороненного в вечной мерзлоте на Аляске. (Этот геном помог объяснить, почему вирус был таким смертоносным, особенно для молодых людей, в отличие от других штаммов гриппа.)
Однако лишь немногие патологические образцы датируются XIX веком. Самый старый образец, который до сих пор исследовал Кальвиньяк-Спенсер, принадлежит пациенту с бешенством 1836 года и хранится в коллекции в Болонье. Его ещё предстоит проанализировать.
«Итак, вопрос был в том, какие еще архивы мы могли бы рассмотреть?» — говорит он. Одним из вариантов был Шпицберген. Бесчисленные поколения гнездящихся морских птиц и других диких животных, вероятно, переносили вирусы, которые могли сохраняться в вечной мерзлоте. Но взять образец оказалось проще, чем думали.
В поисках мерзлой земли
Во второй половине дня в первый день экспедиции Кальвиньяк-Спенсер стоял на поросшем травой склоне в нескольких минутах ходьбы от Лонгйира и осматривал квадратную яму, которую он и его коллеги только что выкопали. Исследователи наткнулись на камни и гравий на глубине около полуметра, и тонкий слой почвы над ними не внушал оптимизма.
«Она полностью оттаяла», — сказал член команды Тим Урих, почвенный микробиолог из Грайфсвальдского университета. «Наша задача — найти места, где почва залегает глубже». Исследователи начали искать следующее место для раскопок.
Найти почву на Шпицбергене, которая оставалась замороженной сотни или тысячи лет, было непросто, но это было крайне важно. Только там у древней РНК был шанс выжить.
Существует несколько причин нестабильности РНК. В сахарах, входящих в ее основу, содержится дополнительный кислород, из-за чего она с большей вероятностью может расщепиться. Кроме того, РНК обычно одноцепочечная, в то время как ДНК обычно состоит из двух цепей, переплетенных в двойную спираль, что придает ей стабильность.
Но самая большая проблема — это рибонуклеазы, небольшие ферменты, которые разрушают РНК. Организмы используют их для метаболизма избыточных клеточных РНК и в качестве защиты от патогенов, в том числе РНК-содержащих вирусов. Рибонуклеазы, также известные как РНКазы, встречаются повсеместно и очень стабильны.
Исследователи когда-то думали, что РНК, которой в клетках гораздо больше, чем ДНК, может сохраняться благодаря своему количеству. В 1985 году Сванте Паабо опубликовал основополагающую работу о ДНК, извлеченной из мумий. Франко Ролло из Университета Камерино описал фрагменты РНК, обнаруженные в семени кресс-салата возрастом 1600 лет.
Но древняя ДНК быстро стала популярной темой для исследований, и ученые использовали ее для изучения жизни все глубже и глубже в прошлом. В 2013 году они опубликовали геном лошади, жившей более полумиллиона лет назад.
В 2022 году они провели секвенирование ДНК многочисленных растений и животных, замороженных во льдах Гренландии более чем на 2 миллиона лет, что позволило получить представление о существовавшей тогда экосистеме. РНК отошла на второй план, поскольку большая часть финансирования палеогеномики приходилась на древнюю ДНК. К настоящему времени методы выделения и очистки древних нуклеиновых последовательностей «ориентированы на ДНК, а не на РНК».
Однако в начале 2000-х годов исследователи изучали образцы, хранившиеся в Демократической Республике Конго в формалине десятилетиями, в поисках ВИЧ. РНК часто сохранялась лучше, чем ДНК.
Рибонуклеазы могут быть деактивированы формалином или холодом. Как только внешние факторы исчезнут, исследователи смогут обнаружить РНК возрастом 2 миллиона лет.
Пандемия COVID-19 подогрела интерес к древней РНК, поскольку она может содержать информацию об эволюции коронавирусов, родственных SARS-CoV-2.
Естественный архив РНК-вирусов на Шпицбергене открыл бы возможности для других исследований, например, эволюции гриппа до пандемии 1918 года. Кальвиньяк-Спенсер не был до конца уверен в том, что может найти команда: в холодной почве могли скрываться десятки вирусов. Пока он просто хотел доказать, что архив существует.
Успеть до потепления
В оставшейся части первого дня группа тащила свое снаряжение по арктической тундре, останавливаясь то тут, то там, чтобы выкопать яму. Но земля нигде не была промерзшей, даже на глубине 1 метра.
На Шпицбергене наблюдается более резкое повышение температуры, чем в большинстве других мест, и ученым приходится с каждым летом копать все глубже, чтобы добраться до вечной мерзлоты. Хранилище вирусов, если оно существует, может разрушаться — ещё одна причина провести исследование сейчас.
На второй день команда отправилась к серии отвесных скал, где в период размножения собираются тысячи птиц, особенно малые кайры. Рядом паслись северные олени, а вокруг бродила песцовая лисица.
«Идея состоит в том, чтобы взять пробы в местах, где на протяжении веков и тысячелетий обитало огромное количество животных», — сказал Кальвиньяк-Спенсер.
Исследователи снова начали копать и то тут, то там натыкались на что-то похожее на промерзшую землю. Один из членов команды с помощью молотка вбил в землю длинный полый металлический цилиндр и вытащил из него цилиндрический образец грунта.
Кальвиньяк-Спенсер и аспирантка Лилли Гралла надели маски, перчатки и пластиковые нарукавники, чтобы защитить образцы от современных вирусов. Они опустились на колени на травянистую почву и вырезали из сердцевины небольшие кусочки.
С помощью продезинфицированного металлического пинцета Гралла поместила образцы вечной мерзлоты в небольшие пробирки Эппендорфа. На крышке каждой пробирки был QR-код, который помогал исследователям отслеживать, когда и где был взят образец.
Затем Гралла поместила пробирки в дьюар — по сути, это огромный термос, охлаждаемый жидким азотом. Образцы должны были оставаться замороженными до тех пор, пока Гралла не достанет их в лаборатории в Германии, чтобы проверить, содержат ли они РНК.
Череда экспедиций
Экспедиция на Шпицберген не первая, кто пытается найти древнюю РНК за пределами музейных образцов. В 2014 году исследователи опубликовали частичный геном нового вируса, обнаруженного в замороженных фекалиях карибу в Канаде, возраст которых составляет около 700 лет. В том же году исследователи сообщили о полном геноме вируса, выделенного из 750-летних зерен ячменя в Египте. В 2018 году в другой статье был описан растительный вирус, обнаруженный в древних початках кукурузы, найденных в Аризоне.
Кальвиньяк-Спенсер тоже пытается попытать счастья в Антарктиде. В 2023 году он прочитал во французской газете статью о работе Стива Эмсли, орнитолога и археолога из Университета Северной Каролины в Уилмингтоне, который, по сути, изучает историю пингвинов. С 2001 года Эмсли регулярно ездит в Антарктиду в поисках старых мест гнездования пингвинов Адели. Когда он их находит, то начинает копать лед — а значит, и прошлое — слой за слоем, находя фрагменты яичной скорлупы, перья, кости и даже целые мумифицированные птицы, которым иногда тысячи лет.
Кальвиньяк-Спенсер сразу же задался вопросом, есть ли в мумиях древние РНК-вирусы. Он связался с Эмсли, и тот прислал ему образцы из горла, трахеи, ребер и клоаки мумий. Кальвиньяк-Спенсер говорит, что его лаборатории удалось собрать воедино геномы нескольких вирусов, в том числе почти полный геном ротавируса, возраст которого составляет около 1900 лет.
Как и в случае с другими заявлениями о древней РНК, эта работа, которая еще не опубликована, неизбежно вызовет вопросы о лабораторном загрязнении. Например, исследование 1999 года, в котором сообщалось о вирусе томатной мозаики во льду возрастом до 140 000 лет, было встречено скептически.
Кальвиньяк-Спенсер признает, что у ротавируса пингвинов отсутствуют два типичных признака древности. У него нет характерного U-образного распределения повреждений на концах фрагментов РНК известного как «смайлик» — хотя это может быть связано с исключительной сохранностью вируса пингвинов.
Когда он добавил эту последовательность в генеалогическое древо родственных вирусов, она оказалась не на короткой ветке, как можно было бы ожидать от вируса, который отличается от современных вирусов и ближе к вирусу-предшественнику. Но Кальвиньяк-Спенсер говорит, что длинные участки РНК могли сохраниться благодаря исключительной сохранности генома пингвинов. Он также отмечает, что у ротавирусов необычный двухцепочечный геном из РНК, который может быть более устойчивым.
По словам Кальвиньяк-Спенсер, мумии пингвинов — это наилучший вариант для сохранения РНК: «Они находились в очень холодных и очень сухих условиях. Лучше и быть не может».
Он надеется найти то же самое на Шпицбергене. На третий день экспедиции Кальвиньяк-Спенсер и другие члены команды отправились в другое место, где коллеги заметили обнаженную вечную мерзлоту. На холодном ветру они копали, брали керны и снова брали пробы — к этому моменту работа уже стала рутинной. На следующий день они упаковали образцы и вылетели обратно в Германию.
Некоторые попытки стали провальными
На склоне холма с видом на Лонгйир находится старое кладбище, где всего несколько рядов белых крестов, бросающих вызов вечному ветру. Оно напоминает о предыдущей попытке изучить историю вирусов на Шпицбергене.
В 1998 году канадский географ-медик Кирсти Дункан возглавила экспедицию по эксгумации тел семи шахтеров, умерших от испанского гриппа в 1918 году. Гробы оказались не так глубоко в земле, как ожидалось, возможно, из-за морозного пучения — явления, из-за которого власти Шпицбергена в 1950 году запретили захоронения в гробах. Тела сохранились плохо. В отличие от группы Таубенбергера, которая годом ранее взяла образцы на Аляске, команде Дункана не удалось выделить ни одного фрагмента вируса гриппа.
Экспедиция Кальвиньяка-Спенсера, состоявшаяся 27 лет спустя, тоже может оказаться безрезультатной. Он оценивает вероятность обнаружения какого-либо древнего вируса в своих образцах, которые сейчас благополучно хранятся в берлинском морозильнике, примерно в 10%.
«Но на данном этапе, прежде чем я скажу, что это невозможно, я просто попробую», — говорит он и при необходимости пробует снова. Он уже планирует еще одну поездку на Шпицберген в поисках вирусов.
Недавно группа геологов и биологов под руководством Калифорнийского университета воскресила древние микробы, которые находились во льду в туннеле Инженерного корпуса армии США — в некоторых случаях около 40 тысяч лет.